[1]王永娟,崔平福,朱善元,等.番鸭呼肠孤病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立[J].江苏农业学报,2017,(06):1321-1326.[doi:doi:10.3969/j.issn.1000-4440.2017.06.018]
　WANG Yong-juan,CUI Ping-fu,ZHU Shan-yuan,et al.Establishment of visual reverse transcription loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP) for muscovy duck reovirus detection[J].,2017,(06):1321-1326.[doi:doi:10.3969/j.issn.1000-4440.2017.06.018]
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番鸭呼肠孤病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立()
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江苏农业学报[ISSN:1006-6977/CN:61-1281/TN]

卷:
期数:
2017年06期
页码:
1321-1326
栏目:
畜牧兽医·水产养殖
出版日期:
2017-12-30

文章信息/Info

Title:
Establishment of visual reverse transcription loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP) for muscovy duck reovirus detection
作者:
王永娟1; 崔平福2; 朱善元1; 夏文龙1; 孟婷1
（1.江苏农牧科技职业学院/江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏泰州225300；2.泰州出入境检验检疫局，江苏泰州225300）
Author(s):
WANG Yong-juan1; CUI Ping-fu2; ZHU Shan-yuan1; XIA Wen-long1; MENG Ting1
（1.Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College, Jiangsu Provincial Key Laboratory of Veterinary Bio-pharmaceutical High Tech Research, Taizhou 225300, China;2.Taizhou Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Taizhou 225300，China）
关键词:
番鸭呼肠孤病毒; 环介导等温扩增; 可视化; 快速检测
Keywords:
muscovy duck reovirus; reverse transcription loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP); visualization; rapid detection
分类号:
S851.34+7.201
DOI:
doi:10.3969/j.issn.1000-4440.2017.06.018
文献标志码:
A
摘要:
为实现番鸭呼肠孤病毒的快速检测，本研究根据GenBank中公布的番鸭呼肠孤病毒σC 蛋白基因的高度保守序列设计了4条引物，通过优化反应体系中各组分的浓度、反应时间和温度，建立了一种灵敏、便捷的RT-LAMP扩增方法。然后以鸭常见病毒基因组为模板，开展特异性检测，最后通过添加SYBR Green I 荧光染料完成可视化LAMP检测方法的建立。结果显示：25 μl LAMP反应体系，镁离子 5×10-5 mmol，dNTP 1.25×10-5mmol，Bst DNA 聚合酶8 U，F3/B3 5×10-6μmol，FIP/BIP 3×10-5μmol，62 ℃，45 min为最优反应条件；在最佳条件下甜菜碱对反应体系影响不明显；对临床样品的阳性检出率与常规RT-PCR检测方法一致，但灵敏度高于PCR方法，最低检测限为10 pg，检测结果可直接通过肉眼观察来判断。该方法为番鸭呼肠孤病毒的可视化RT-LAMP快速检测试剂盒研制奠定了基础。
Abstract:
To realize the rapid detection of duck reovirus, four primers were designed according to the highly conserved sequence of avian reovirus σC protein gene published in GenBank. A sensitive and convenient reverse transcription loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP) method was established by optimizing reaction time, temperature and the concentration of each component in the reaction system. Then, the genome of duck common virus was used as template to detect specificity. Finally, a visualized LAMP detection method was established by adding SYBR Green I fluorescent dyes. The result showed that 25 μl reaction system, Mg2+ 5×10-5mmol, dNTP 1.25×10-5mmol, Bst DNA polymerase 8 U, F3/B3 5×10-6μmol, FIP/BIP 3×10-5μmol, 62 ℃, 45 min was the optimum reaction condition, the influence of betaine on the reaction system was not obvious under the optimal condition. The positive rate of the method was consistent with that of the conventional RT-PCR assay, but the sensitivity was higher than the PCR method, and the minimum detection limit was 10 pg. The results could be determined directly by the naked eye observation. This method laid the foundation for development of rapid detection kit of the RT-LAMP method for the visualization of muscovy duck reovirus.

参考文献/References:

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备注/Memo

备注/Memo:
收稿日期：2017-07-24 基金项目：江苏省教育厅自然科学基金面上项目（16KJB230004）；江苏省“六大人才”高峰第十二批培养对象资助项目（NY023）；江苏省大学生创新创业训练计划校企合作基金项目；安徽省科技攻关项目（1201c0602006）;泰州市科技支撑计划农业项目(TN201703)；江苏省高校优秀科技创新团队资助项目（2050305-44） 作者简介：王永娟（1980-），女，江苏海门人，博士，副教授，主要从事动物传染病防治研究，（E-mail）43088591@qq.com 通讯作者：孟婷， （E-mail）mengting2010@foxmail.com
更新日期/Last Update: 2018-01-03